एन्टीजेन-लिंक्ड इमनोबेसॉर्बेंट परख (एलिसा) एंटीजन का पता लगाने के तरीके

एन्टीजेन-लिंक्ड इमनोब्सॉर्बेंट परख (एलिसा) एंटीजन का पता लगाने के तरीके!

एनजाइम-लिंक्ड इमनोबेसबेंट विधि का उपयोग एंटीजन या एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। अन्य विधियों की तुलना में एलिसा पद्धति के कई फायदे हैं (तालिका २ ..२)।

एलिसा विधि एग्लूटिनेशन और इम्यूनोइलेक्ट्रोफोरेसिस जैसी पुरानी विधियों की तुलना में 10 से 1000 गुना अधिक संवेदनशील है। एलिसा के कई प्रकार के संशोधन उपलब्ध हैं, जिनमें से कुछ यहां वर्णित हैं।

तालिका 27.2: एंजाइम इम्युनोएसे के लाभ

1. एंजाइमों के प्रवर्धन प्रभाव के परिणामस्वरूप अधिक संवेदनशील assays का विकास होता है

2. अभिकर्मकों का एक लंबा शैल्फ जीवन होता है और तुलनात्मक रूप से सस्ते होते हैं

3. परख विन्यास की एक विस्तृत विविधता विकसित की जा सकती है

4. उपकरण कम खर्चीला है और व्यापक रूप से उपलब्ध है

5. कोई विकिरण खतरों

6. छोटी प्रयोगशालाओं में भी किया जा सकता है

एलिसा टू असि एंटीबॉडी

ज्ञात प्रतिजन को एक माइक्रोलिटर प्लेट कुओं (छोटी प्लास्टिक प्लेट, जो कि प्रोटीन बंधन को अधिकतम करने के लिए इलाज किया जाता है, पर लेपित किया जाता है; इसमें 200 कुओं की मात्रा के साथ 96 कुएं होते हैं)।

↓

मानव परीक्षण सीरम को अच्छी तरह से जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

मैं। यदि सीरम में लेपित एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी होते हैं, तो एंटीबॉडी एंटीजन से जुड़ जाते हैं।

↓

अनबाउंड सीरम घटकों को हटाने के लिए कुओं को धोया जाता है।

↓

एंजाइम संयुग्मित मानव विरोधी इम्युनोग्लोबुलिन (संयुग्म के रूप में जाना जाता है) को कुओं में जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

ii। संयुग्म कुएं में प्रतिजन-बाध्य एंटीबॉडी से बांधता है।

iii। यदि परीक्षण सीरम में एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी नहीं होते हैं, तो समाधान में संयुग्मित रहता है।

↓

अनबाउंड संयुग्म को हटाने के लिए कुओं को धोया जाता है।

↓

एक उपयुक्त सब्सट्रेट को कुओं में जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

iv। एंटीजन-एंटीबॉडी में संयुग्म के एंजाइम- सब्सट्रेट पर जटिल कार्यों को संयुग्मित करते हैं और रंगीन उत्पाद बनाने के लिए सब्सट्रेट को विभाजित करते हैं। रंग का विकास इंगित करता है कि कुओं पर लेपित एंटीजन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी परीक्षण सीरम में मौजूद है।

v। रंग का गैर-विकास इंगित करता है कि परीक्षण सीरम में कुओं पर लेपित एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी नहीं हैं।

↓

एक रोक समाधान (आमतौर पर, सल्फ्यूरिक एसिड में) प्रतिक्रिया को रोकने के लिए जोड़ा जाता है। फिर प्लेट को एलिसा रीडर में रखा जाता है और कुओं के ऑप्टिकल घनत्व (OD) को मापा जाता है। आयुध डिपो परीक्षण सीरम में एंटीबॉडी की मात्रा से मेल खाती है।

एंटीबॉडी के ज्ञात सांद्रता का उपयोग करके, एक ग्राफ का निर्माण किया जा सकता है। एंटीबॉडी सांद्रता एक्स अक्ष पर प्लॉट किए जाते हैं और इसी ओडीएस को वाई अक्ष पर प्लॉट किया जाता है और एक वक्र खींचा जाता है। परीक्षण सीरम के OD मान को प्रक्षेपित करके, एक परीक्षण सीरम में एंटीबॉडी की एकाग्रता निर्धारित की जाती है।

एलिसा से परख प्रतिजन:

एक एंटीजन के लिए एक ज्ञात मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में संदर्भित) को माइक्रोएटर कुओं पर लेपित किया जाता है।

↓

एंटीजन को शामिल करने वाले नमूने को अच्छी तरह से जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

मैं। यदि नमूने में संबंधित प्रतिजन होता है, तो प्रतिजन कुएं पर एंटीबॉडी से बांधता है और एक प्रतिजन-एंटीबॉडी जटिल बनाता है।

↓

अनबाउंड सामग्रियों को हटाने के लिए कुओं को धोया जाता है।

↓

एक ज्ञात एंजाइम संयुग्मित mAb (जिसे संयुग्म कहा जाता है) प्रतिजन के खिलाफ कुओं में जोड़ा जाता है और प्लेट को ऊष्मायन किया जाता है।

मैं। यदि कुएं में एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स होता है, तो संयुग्म जटिल में एंटीजन को बांधता है।

ii। यदि एंटीजन-एंटीबॉडी जटिल नहीं है, तो संयुग्म समाधान में रहता है।

↓

अनबाउंड संयुग्म को हटाने के लिए कुओं को धोया जाता है। एक उपयुक्त सब्सट्रेट जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

मैं। यदि कुएं में संयुग्मन होता है, तो संयुग्म का एंजाइम सब्सट्रेट को विभाजित करता है और एक रंगीन उत्पाद बनाता है।

iii। रंग के विकास की अनुपस्थिति इंगित करती है कि नमूने में कोई एंटीजन नहीं है (कुओं पर एंटीबॉडी लेपित के खिलाफ)।

↓

प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एक स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ा जाता है। व्यक्तिगत कुओं के OD को एलिसा रीडर में पढ़ा जाता है। जैसा कि पहले बताया गया है कि एक ग्राफ (एक्स अक्ष पर एंटीजन के अलग-अलग सांद्रता से युक्त और वाई अक्ष पर संबंधित ऑड्स) का निर्माण किया जाता है और वक्र खींचा जाता है। परीक्षण नमूने में एंटीजन की एकाग्रता उसके आयुध डिपो के प्रक्षेप द्वारा निर्धारित की जाती है।

एंटीबॉडी कैप्चर एलिसा विधि:

माइक्रो टिटर प्लेट के कुओं को मानव विरोधी आईजीएम एंटीबॉडी के साथ लेपित किया जाता है।

↓

रोगी का सीरम जोड़ा और ऊष्मायन किया जाता है। सीरम में आईजीएम एंटीबॉडी कुओं पर मानव विरोधी आईजीएम एंटीबॉडी के लिए बाध्य करते हैं।

कुओं को धोया जाता है और फिर एक ज्ञात एंटीजन जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

मैं। यदि एंटीजन के खिलाफ आईजीएम एंटीबॉडी कुएं में मौजूद हैं, तो एंटीजन आईजीएम एंटीबॉडी से बंध जाएगा और कुएं में रहेगा।

↓

अनबाउंड एंटीजन को हटाने के लिए कुओं को धोया जाता है

↓

प्रतिजन के लिए एक एंजाइम संयुग्मित mAb जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

मैं। यदि एंटीजन कुएं में मौजूद है (एंटी आईजीएम-आईजीएम-एंटीजन कॉम्प्लेक्स), तो संयुग्म प्रतिजन को बांध देगा।

↓

अनबाउंड संयुग्म को हटाने के लिए कुओं को धोया जाता है और सब्सट्रेट जोड़ा जाता है।

मैं। रंग का विकास इंगित करता है कि एंटीजन के खिलाफ आईजीएम एंटीबॉडी रोगी के सीरम में मौजूद हैं।

ii। रंग का गैर-विकास इंगित करता है कि रोगी के सीरम में एंटीजन के खिलाफ IgM एंटीबॉडी नहीं होते हैं।

↓

स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ा जाता है और कुओं के OD को व्यक्तिगत रूप से एलिसा रीडर में मापा जाता है। एंटीजन के खिलाफ आईजीएम एंटीबॉडी की मात्रा को पहले वर्णित के अनुसार एक ग्राफ खींचकर निर्धारित किया जा सकता है।

एक एंटीजन के खिलाफ IgG एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक समान प्रक्रिया अपनाई जा सकती है।

एलिसा तकनीकों में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एंजाइम हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज और क्षारीय फॉस्फेटेज (तालिका 27.3) हैं। ये एंजाइम सहसंयोजी रूप से mAbs में जोड़े जाते हैं। इन एंजाइमों द्वारा रंगीन उत्पादों के उत्पादन के लिए कई प्रकार के सबस्ट्रेट्स पर कार्य किया जाता है। चूंकि एलिसा विधि का अंतिम चरण एंजाइमी है, एलिसा विधि अत्यंत संवेदनशील है (यानी, एंटीजन या एंटीबॉडी की बहुत कम सांद्रता का पता लगाया जा सकता है)।

एलिसा assays की संवेदनशीलता अतिरिक्त अभिकर्मकों का उपयोग करके बढ़ाया जाता है (उदाहरण के लिए, बायोटिन / एविडिनिममुनोसेकस)। हाल ही में, सहसंसाधक उत्पादों का उत्पादन करने वाले हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट के उपयोग ने संवेदनशीलता को और बढ़ा दिया है। प्रतिक्रिया की दर का मापन, एक निश्चित तात्कालिक पर प्रतिक्रिया की सीमा के बजाय, अधिक सटीक मात्रात्मक एलिसा परिणाम देता है।

सारणी 27.3: एंजाइम प्रतिरक्षियों में प्रयुक्त एंजाइमों के लक्षण:

बायोटिन-एविडिन संवर्धित एलिसा:

एमएबी को एक एंजाइम के साथ लेबल करने के बजाय, एमएबी को बायोटिन (विटामिन बी ₁₂ ) के साथ लेबल किया जा सकता है।

↓

फिर एविडिन (अंडे का सफेद रंग का एक प्रोटीन घटक) नामक एंजाइम जोड़ा जाता है।

↓

एविनिन बायोटिन को बहुत अधिक संवेदनशीलता और आत्मीयता के साथ बांधता है। इसके बाद सब्सट्रेट जोड़ा जाता है। एंजाइम (mAb-biotin-avidin-enzyme में) सब्सट्रेट पर जटिल कार्य करता है और रंगीन उत्पाद का उत्पादन करता है।

इम्युनो-फ्लोरोसेंट assays में बायोटिन-एविडिन वृद्धि का भी उपयोग किया जाता है।

माइक्रोपार्टिकल एंजाइम इम्यूनोसैस:

एंटीजन या एंटीबॉडी के साथ माइक्रो टिटर प्लेट कुओं को कोटिंग करने के बजाय, छोटे मोतियों (व्यास में 1 मिमी) को एंटीजन या एंटीबॉडी के साथ लेपित किया जाता है और एलिसा assays का प्रदर्शन किया जाता है। माइक्रोपार्टिकल्स एंटीजन या एंटीबॉडी कोटिंग के लिए बड़ा सतह क्षेत्र प्रदान करते हैं ताकि एंटीजन या एंटीबॉडी की उच्च सांद्रता को लेपित किया जा सके, जो बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक समय को कम करने में मदद करता है।

फ्लोरोसेंट एंजाइम इम्युनोसे अन्य ईआईए के समान है सिवाय इसके कि वे फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट का उपयोग करते हैं। फ्लोरोसेंट ईआईए में, फ्लोरोफोरे एक एंजाइम प्रतिक्रिया द्वारा उत्पन्न होता है। इसकी इष्टतम तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरोफोरे के उत्तेजना के बाद, एक विशेषता तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश उत्सर्जित होता है। उत्सर्जित फ्लोरोसेंट प्रकाश मापा जाता है।

समय-प्रदीप्त फ़्लोरोइम्मुनोसे

इस विधि को परख संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए विशेष इंस्ट्रूमेंटेशन और विशेष फ्लोरोसेंट लेबल की आवश्यकता होती है। इस परख में प्रयुक्त फ्लोरोसेंट लेबल उत्तेजना और उत्सर्जन के बीच 100 ns या उससे अधिक की समयावधि के साथ विलंबित प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करता है। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए जिम्मेदार अधिकांश पदार्थों की एक छोटी क्षय अवधि होती है। इसलिए, देरी प्रतिदीप्ति संकेत की माप पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के प्रभाव को कम करेगा।

इस उद्देश्य को विशेष समय हल फ़्लोरोमीटर के उपयोग से प्राप्त किया जाता है जो फ्लूरोफ़ोर को उत्तेजित करने वाली तेज़ प्रकाश नाड़ी का निर्माण करता है। उत्तेजना के थोड़ी देर बाद प्रतिदीप्ति को मापा जाता है। इस प्रकार, गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि का प्रभाव, जो आम तौर पर 10 एनएस से कम हो जाता है, को समाप्त किया जा सकता है।

विलंबित प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने वाले फ्लोरोफोर्स हैं:

मैं। लगभग 100 एनएस के क्षय समय के साथ पाइरीन डेरिवेटिव।

ii। दुर्लभ पृथ्वी धातु केलेट के लेबल [जैसे यूरोपोपियम (Eu ³⁺ ), समैरियम (Sm ³⁺ ), और टेरिबियम (Tb ³⁺ )] जिनके बारे में 50 से 100। का बहुत लंबा क्षय होता है।

रसायनयुक्त इम्यूनोसैसे:

रसायनयुक्त इम्यूनोसैस (CL-EIA) विभिन्न एंजाइमों के साथ प्रतिक्रिया करने वाले रसायनयुक्त सब्सट्रेट का उपयोग करते हैं। रसायनयुक्त सब्सट्रेट-एंजाइम प्रतिक्रिया, बायोलुमिनसेंस के समान प्रकाश उत्पन्न करती है। रसायन विज्ञान ईआईए सिस्टम संवेदनशीलता, समय दक्षता और प्रक्रियात्मक सादगी के संदर्भ में आरआईए पर निश्चित सुधार है।

केमिल्यूमिनेसिंस इम्यूनोएसेज़, लेबल के रूप में केमिलुमिनेसिसन जनरेटिंग अणुओं का उपयोग करते हैं।

मैं। ल्यूमिनॉल डेरिवेटिव

ii। एक्रिडिनियम एस्टर

iii। नाइट्रोफिनाइल ऑक्सालेट डेरिवेटिव

iv। इलेक्ट्रोकैमिलिनेसिनेस के लिए ट्रिप्रोपिलमाइन के साथ रूथेनियम ट्राइ-बाइप्रिडिल

v। मूल रूप से, परख विधियाँ RIA / FIA से भिन्न नहीं होती हैं।