एचएलए: हिस्टोकंपैटिबिलिटी टेस्टिंग मेथड्स

हिस्टोकंपैटिबिलिटी टेस्टिंग मेथड्स!

एचएलए प्रणाली बड़े पैमाने पर बहुरूपी है। एचएलए एलील्स की बहुरूपी प्रकृति शुरू में सेरोलॉजिकल विधियों द्वारा पाई और परिभाषित की गई थी और एचएलए एंटीजन को नंबर दिए गए थे। बाद में यह पाया गया कि एक ही सीरोलॉजिकल विशिष्टता वाले एंटीजन में अलग-अलग अमीनो एसिड अनुक्रम हो सकते हैं। 1999 तक, ज्ञात एचएलए एलील्स की संख्या 1000 से अधिक हो गई, और संख्या अभी भी बढ़ रही है। व्यापक बहुरूपता के कारण, एचएलए एलील्स का नामकरण जटिल है और किसी व्यक्ति के लिए नामकरण को समझना भी मुश्किल है, जब तक कि व्यक्ति हिस्टोकंपैटिबिलिटी फ़ील्ड में न हो।

पहले अनुक्रमित एलील्स को दो अंकों के साथ नाम दिए गए थे जो उनकी सीरोलॉजिकल विशिष्टता के अनुरूप थे। पहले दो अंकों का अनुसरण दूसरे दो अंकों द्वारा किया जाता है जो एचएलए प्रणाली के कारकों के लिए डब्ल्यूएचओ नामकरण समिति द्वारा नामकरण के कालानुक्रमिक क्रम को इंगित करता है। (उदाहरण के लिए। HLA-A2 जीन से अनुक्रमित पहले एलील का नाम HLA-A 0201 था, और दूसरे एलील अनुक्रम का नाम HLA-A 0202 था।)

HLA टाइपिंग सीरोलॉजिकल टाइपिंग विधियों या आणविक टाइपिंग विधियों द्वारा की जाती है। सीरोलॉजिकल एचएलए टाइपिंग विधियां एचएलए अणुओं के एपिटोप्स का पता लगाती हैं, जबकि आणविक विधियां न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों का पता लगाती हैं।

मैं। HLA टाइपिंग जो एलील्स के समूहों को परिभाषित करता है (आमतौर पर सीरोलॉजिकल विशिष्टताओं को अनुमानित करता है) को निम्न-रिज़ॉल्यूशन या जेनेरिक टाइपिंग के रूप में संदर्भित किया जाता है (उदाहरण के लिए, HLA- DRBl-04)।

ii। टाइपिंग जो सभी ज्ञात युग्मों को हल करती है, को उच्च-रिज़ॉल्यूशन HLA टाइपिंग के रूप में संदर्भित किया जाता है (उदाहरण के लिए, HLA- DR BI x401)।

iii। टाइपिंग जो कि सीरोलॉजिकल विशिष्टताओं से परे है, लेकिन एलील स्तर को प्राप्त नहीं करता है, को इंटरमीडिएट -resolution टाइपिंग कहा जाता है (उदाहरण के लिए, HLA- DRBl-0401/09/13/16/21/26/33)।

नेशनल मैरो डोनर प्रोग्राम ने इन जटिल मध्यवर्ती-रिज़ॉल्यूशन डेटा के प्रबंधन की सुविधा के लिए कोड बनाया है। इस प्रणाली में, HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / के लिए नाम DRBl- 04EJV है।

सिस्टोलिक विधियों द्वारा हिस्टोकम्पैटिबिलिटी परीक्षण:

लिम्फोसाइट्स का उपयोग सीरोलॉजिकल एचएलए टाइपिंग, एंटीबॉडी स्क्रीनिंग और क्रॉस मिलान के लिए किया जाता है।

HLA टंकण के लिए लिम्फोसाइटों का अलगाव:

मैं। परिधीय शिरापरक रक्त को फिकोल के साथ मिश्रित किया जाता है- हाइपैक और सेंट्रीफ्यूगेड। परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से युक्त परत को एस्पिरेटेड, धोया और उपयोग किया जाता है।

ii। लिम्फ नोड्स से अलग लिम्फोसाइट्स और कैडर्स के प्लीहा का उपयोग किया जाता है।

iii। वर्ग II एंटीजन के लिए HLA टाइपिंग समृद्ध B सेल आबादी के साथ की जाती है (सामान्य परिधीय रक्त T कोशिकाओं के लगभग 80 प्रतिशत टी कोशिकाओं को आराम कर रहे हैं जिनकी कक्षा II एंटीजन की सतह पर कमी है)।

iv। एंटी-सीडी 2 या एंटी-सीडी 3 एमएबी लेपित चुंबकीय मोती का उपयोग टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है; और बी-कोशिकाओं को अलग करने के लिए एंटी-सीडी 19 एमएबी लेपित चुंबकीय मोती का उपयोग किया जाता है।

लिम्फोसाइटों के एचएलए एंटीजन का पता लगाना:

माइक्रो साइटोटोक्सिसिटी परख एक पूरक-निर्भर लिम्फ साइटोटॉक्सिसिटी परख है। एचएलए एंटीजन के खिलाफ विभिन्न एंटीबॉडी के साथ लेपित कुओं वाले जमे हुए टाइपिंग ट्रे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।

लगभग 2000 लिम्फोसाइटों को ट्रे के प्रत्येक कुएं में भेज दिया जाता है और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया जाता है। (प्रत्येक अच्छी तरह से एंटीबॉडी लिम्फोसाइटों की सतह पर विशिष्ट एचएलए एंटीजन के लिए बाध्य करते हैं, यदि मौजूद हो।)

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पांच μl पूरक (आमतौर पर, खरगोश सीरम) प्रत्येक कुएं में जोड़ा जाता है और 60 मिनट के लिए ऊष्मायन किया जाता है, (पूरक प्रोटीन लिम्फोसाइटों की मृत्यु का कारण बनता है जो mAbs के साथ लेपित होते हैं। लिम्फोसाइटों के साथ mAb बंधन की अनुपस्थिति में, पूरक सक्रिय नहीं होता है और लिम्फोसाइट्स) मारे नहीं जाते)।

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डाई ईओसिन वाई, इसके बाद फॉर्मलाडेहाइड (फॉर्मलाडिहाइड प्रतिक्रिया को ठीक करता है) जोड़े जाते हैं।

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फिर प्रत्येक कुएं में मृत कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं को एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत गिना जाता है।

मैं। सूजन और अंधेरे कोशिकाएं मृत कोशिकाएं हैं (डाई ईओसिन वाई मृत कोशिकाओं में प्रवेश करती है)।

ii। उज्ज्वल और अपवर्तक कोशिकाएं जीवित कोशिकाएं हैं (डाई ईोसिन वाई जीवित कोशिकाओं में प्रवेश नहीं करती है)।

ट्रे में प्रत्येक कुएं को मृत कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं के लिए व्यक्तिगत रूप से देखा जाता है। प्रत्येक कुएं में मृत कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना की जाती है और स्कोरिंग तालिका 27.5 के अनुसार की जाती है।

तालिका 27.5: एचएलए के लिए लिम्फ साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण का स्कोरिंग:

कुएं में मृत लिम्फोसाइटों का प्रतिशत	स्कोर	व्याख्या
0-10	1	नकारात्मक
11-20	2	शंका सकारात्मक
21-50	4	कमजोर सकारात्मक
51-80	6	सकारात्मक
81-100	8	मजबूत सकारात्मक

किसी व्यक्ति का HLA प्रकार पूरक-निर्भर लिम्फ साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण में उपयोग किए गए विभिन्न एंटीसेरा के साथ व्यक्ति के लिम्फोसाइटों की प्रतिक्रिया की व्याख्या द्वारा निर्धारित किया जाता है।

मैं। प्रत्येक व्यक्ति को लिम्फोसाइटों की सतह पर दो एचएलए-ए, दो एचएलए-बी और दो एचएलए-सी एंटीजन होने की उम्मीद है।

ii। यदि कोई व्यक्ति परीक्षण में केवल एक HLA-A या HLA-B या HLA-C एंटीजन दिखाता है, तो संभवतः वह व्यक्ति उस विशेष प्रतिजन के लिए समरूप है या परीक्षण में उपयोग किए गए एंटीसेरा के पैनल में दूसरे के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी नहीं है एंटीजन या लिम्फोसाइट सतह पर एचएलए अणुओं की कम अभिव्यक्ति है।

HLA-DR और HLA-DQ एंटीजन के लिए पूरक-निर्भर लिम्फ साइटोटॉक्सिसिटी परख mABs लेपित चुंबकीय मोतियों या नायलॉन ऊन से अलग बी कोशिकाओं द्वारा पृथक बी कोशिकाओं का उपयोग करके किया जाता है।

ज्यादातर HLA टाइपिंग सीरा बहुपत्नी महिलाओं से प्राप्त की जाती है। चूंकि उत्परिवर्ती महिलाओं को भ्रूण के एचएलए एंटीजन के लिए बार-बार उजागर किया जाता है, बहुपत्नी महिलाओं के सीएलए में एचएलए एंटीजन के एंटीबॉडी होते हैं। लगभग 200 विभिन्न एंटीसेरा का उपयोग किसी व्यक्ति के एचएलए एंटीजन को टाइप करने के लिए किया जाता है।

शुरू में यह सोचा गया था कि एचएलए एंटीजन में से प्रत्येक के लिए एमएबी विकसित किया जा सकता है और एचएलए टाइपिंग सरल होगी। लेकिन कई mAbs आम एपिटोप्स के लिए बाध्य होते हैं, बल्कि HLA एंटीजन के निजी एपिटोप्स के लिए। इसके अलावा, कई murine mAbs पूरक को ठीक नहीं करते हैं (और इसलिए उनके उपयोग निर्भरता में लिम्फ साइटोटॉक्सिसिटी assays सीमित है)।

हालांकि, murine mAbs का उपयोग एलिसा विधि और प्रवाह साइटोमेट्री विधि में किया जा सकता है, जिसे पूरक की आवश्यकता नहीं है। देर से, कई प्रयोगशालाएं सीरोलॉजिक एचएलए टाइपिंग के बजाय आणविक एचएलए टाइपिंग का उपयोग करना पसंद करती हैं।

एल-आइएलए एंटीजन (एंटीबॉडी स्क्रीनिंग) के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता के सीरम की स्क्रीनिंग:

एक प्रतीक्षा अंग प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता के सीरम में एचएलए एंटीजन के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति आमतौर पर पूरक-निर्भर लिम्फ साइटोटोक्सिसिटी द्वारा की जाती है। ज्ञात एचएलए एंटीजन और पूरक के साथ लिम्फोसाइट्स प्राप्तकर्ता के सीरम के साथ मिश्रित होते हैं। उपयुक्त ऊष्मायन के बाद, मृत लिम्फोसाइटों और जीवित लिम्फोसाइटों को गिना जाता है। प्रतिशत पैनल प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी (PRA) की गणना तब की जाती है।

PRA = सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या / कुल पैनल कोशिकाओं की संख्या x 100

PRA HLA प्रतिजनों के प्रति प्रतीक्षा प्राप्तकर्ता के संवेदीकरण की सीमा को इंगित करता है।

एलिसा विधि स्क्रीन सीरम एचएलए एंटीबॉडी के लिए:

एलिसा विधि आसान, तेज है, और लाइव लिम्फोसाइटों के साथ-साथ पूरक की आवश्यकता नहीं है। आत्मीयता-शुद्ध एचएलए एंटीजन को माइक्रोएटर प्लेट की दीवारों पर लेपित किया जाता है

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प्राप्तकर्ता का सीरम जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है

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धोने के बाद, एंजाइम संयुग्मित मानव विरोधी आईजीजी को जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

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धोने के बाद, सब्सट्रेट को जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

मैं। किसी विशेष कुएं में रंग का विकास उस विशेष कुएं पर लेपित HLA प्रतिजन के प्रति IgG एंटीबॉडी की उपस्थिति को इंगित करता है।

ii। एक विशेष कुएं में रंग का विकास न होना उस कुएं पर लेपित विशेष रूप से एचएलए एंटीजन के एंटीबॉडी की अनुपस्थिति को इंगित करता है।

सीरम एचएलए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए साइलोमीटर प्रवाहित करें:

HLA एंटीजन के साथ लेपित माइक्रो मोतियों को रोगी के सीरम और फिर फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी मानव आईजीजी एंटीबॉडी के साथ जोड़ा जाता है। पृष्ठभूमि के ऊपर दागने वाले मोतियों का प्रतिशत रोगी के प्रतिशत पैनल प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी (PRA) का माप प्रदान करता है।

विपरीत मिलान:

यदि प्रतीक्षा प्राप्तकर्ता के रक्त में दाता एचएलए एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी होते हैं, तो प्रत्यारोपण पर, दाता कोशिकाओं पर एचएलए एंटीजन को प्राप्तकर्ता के एंटीबॉडी द्वारा हमला किया जाएगा। इसलिए प्रत्यारोपण से पहले, यह जानना आवश्यक है कि प्राप्तकर्ता के पास दाता एचएलए एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी हैं या नहीं।

यदि दाता एचएलए एंटीजन विशिष्ट एंटीबॉडी प्राप्तकर्ता के सीरम में मौजूद हैं, तो प्रत्यारोपण को अस्वीकार कर दिया जाएगा। प्रस्तावित दाता एचएलए एंटीजन के खिलाफ प्रतीक्षा प्राप्तकर्ता की सीरम एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के लिए क्रॉस मिलान किया जाता है।

परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों के साथ लिम्फ साइटोटोक्सिसिटी क्रॉस मिलान:

प्रस्तावित दाता के परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स (जिसमें लगभग 80 प्रतिशत टी कोशिकाएं होती हैं (जो एमएचसी वर्ग I एंटीजन को सहन करती हैं) और 20 प्रतिशत बी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स (जो एमएचसी वर्ग I और वर्ग II एंटीजन को सहन करते हैं) को प्रतीक्षा प्राप्तकर्ता के सीरम और ऊष्मायन के साथ मिलाया जाता है ।

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पूरक जोड़ा और ऊष्मायन किया गया है।

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डाई ईओसिन वाई को जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है।

मैं। मृत और व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिना जाता है और मृत कोशिकाओं की प्रतिशत गणना की जाती है। 50 प्रतिशत या अधिक कोशिका मृत्यु एक मजबूत सकारात्मक क्रॉस मैच को इंगित करता है (यानी, प्राप्तकर्ता के सीरम में एंटीबॉडी होते हैं जो दाता एचएलए एंटीजन के साथ प्रतिक्रिया करने में सक्षम होते हैं)। एक प्राप्तकर्ता और एक प्रस्तावित दाता के बीच एक मजबूत सकारात्मक क्रॉस मैच दाता से प्राप्तकर्ता को अंग प्रत्यारोपण के लिए एक contraindication है।

यह पता लगाने के लिए कि क्या प्राप्तकर्ता के एंटीबॉडी को कक्षा I या वर्ग II एंटीजन के खिलाफ निर्देशित किया जाता है, टी सेल लिम्फ साइटोटॉक्सिसिटी क्रॉस मैचिंग (समृद्ध टी कोशिकाओं का उपयोग करके) या बी सेल लिम्फ साइटोटॉक्सिसिटी क्रॉस मैचिंग (समृद्ध बी कोशिकाओं का उपयोग करके) क्रमशः किया जाता है।

फ्लो साइटोमीटर क्रॉस मैचिंग लिम्फोसाइटों की सतह पर एचएलए एंटीजन के खिलाफ आईजीजी एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए दृश्य सेरोलोगिक तरीकों की तुलना में 30-250 गुना अधिक संवेदनशील है।

प्रस्तावित दाता के परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों को लेबल के साथ जोड़ा जाता है (उदाहरण के लिए, एक फ्लोरोसेंट डाई जो हरी बत्ती का उत्सर्जन करता है) एंटी-सीडी 3 एमएबी, जो टी कोशिकाओं से बंधता है।

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लेबल वाले एआई-सीडी 3 बाध्य टी कोशिकाओं को प्रवाह कोशिकामापी में बी कोशिकाओं से अलग किया जाता है।

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प्रतीक्षा प्राप्तकर्ता के सीरम के साथ अलग, सना हुआ टी कोशिकाओं को अब ऊष्मायन किया जाता है।

मैं। दाता टी सेल एचएलए एंटीजन के खिलाफ प्राप्तकर्ता की सीरम एंटीबॉडी, यदि मौजूद है, तो टी कोशिकाओं से बंधेगी।

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धोने के बाद, एक फ्लूरोक्रोम (जो हरे रंग के अलावा, एक रंग का उत्सर्जन करता है, लाल रंग कहते हैं) मानव विरोधी आईजीजी लेबल किया जाता है और जोड़ा जाता है।

ii। मानव विरोधी IgG लेबल वाला फ़्लोरोक्रोम प्राप्तकर्ता के HLA एंटीबॉडी से बंधेगा, जो दाता टी कोशिकाओं से बंधे होते हैं।

प्रवाह साइटोमीटर टी कोशिकाओं (लाल और हरे रंग) और टी कोशिकाओं (हरा रंग) की संख्या को गिनता है और एक हिस्टोग्राम बनाता है।

लिम्फोसाइटों के खिलाफ ऑटोएंटिबॉडी के लिए क्रॉस मिलान:

एक क्रॉस मैच के दौरान, प्राप्तकर्ता के सीरम में लिम्फोसाइटों के खिलाफ ऑटोएंटिबॉडी गैर-विशेष रूप से दाता लिम्फोसाइटों को बांध सकती है और एक गलत-सकारात्मक क्रॉस मैच परिणाम दे सकती है; और फलस्वरूप, दाता को गलती से विशेष प्राप्तकर्ता को अंग दान करने से अयोग्य घोषित कर दिया जाता है। ऑटोएंटिबॉडी विशिष्ट एंटी-डोनर एंटीबॉडी की उपस्थिति को भी मुखौटा कर सकते हैं।

ऑटो क्रॉस मैच द्वारा लिम्फोसाइटों के लिए ऑटोएंटिबॉडी की उपस्थिति का पता लगाया जाता है, जिसमें प्राप्तकर्ता के खुद के लिम्फोसाइट्स और सीरम एक मानक साइटोटॉक्सिसिटी टेस्ट में संयुक्त होते हैं। ऑटोएंटिबॉडी क्रॉस मैच नियमित रूप से प्रत्येक सीरम के लिए सभी जीवित दाता क्रॉस मैचों के साथ संयोजन में किया जाता है जो परीक्षण किया जाता है।

HLA टाइपिंग के लिए आणविक जीवविज्ञान विधियाँ:

अधिकांश आणविक टाइपिंग के तरीकों में टाइपिंग के लिए आवश्यक HLA जीन सेगमेंट को चुनिंदा रूप से बढ़ाने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) तकनीक का उपयोग किया जाता है।

अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमिंग (एसएसपी) टाइपिंग:

व्यक्ति का डीएनए कोशिकाओं या ऊतकों से निकाला जाता है

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डीएनए को अलग-अलग एचएलए जीन के लिए अलग-अलग प्राइमर सेट वाली ट्यूबों में जोड़ा जाता है। प्राइमरों का एक अतिरिक्त सेट सभी ट्यूबों में प्रवर्धन के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल है।

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पीसीआर प्रतिक्रिया के अन्य घटक (जैसे डीएनए न्यूक्लियोटाइड्स, डीएनए पोलीमरेज़, बफर) को जोड़ा जाता है और थर्मल साइकलिंग किया जाता है।

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प्रवर्धित उत्पादों को एथिडियम ब्रोमाइड के साथ जेल में इलेक्ट्रोफोरस किया जाता है और यूवी प्रकाश के तहत फोटो खिंचवाया जाता है।

मैं। बैंड की उपस्थिति इंगित करती है कि डीएनए नमूने में विशेष रूप से एचएलए प्रकार के अनुरूप अनुक्रम है।

ii। बैंड की अनुपस्थिति इंगित करती है कि डीएनए नमूने में एचएलए प्रकार का विशेष अनुक्रम नहीं है।

iii। व्याख्या के लिए आंतरिक प्रवर्धन नियंत्रण बैंड मौजूद होना चाहिए।

एचएलए टाइपिंग के लिए प्राइमरों के सेट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।

मैं। HLA-A, B और C के लिए लगभग 100-200 अभिक्रियाएँ आवश्यक हैं।

ii। HLA-DRB टाइपिंग के लिए लगभग 20-30 प्रतिक्रियाएँ आवश्यक हैं।