न्युट्रोफिल समारोह assays
न्युट्रोफिल समारोह assays!
1. न्युट्रोफिल के केमोटैक्सिस का आकलन निम्नलिखित विधियों द्वारा किया जा सकता है:
ए। संशोधित बॉयडेन चैम्बर परख:
बॉयडेन चैंबर में ऊपरी और निचले चैंबर होते हैं जो छोटे ताकना आकार वाले फ़िल्टर द्वारा अलग होते हैं।
न्युट्रोफिल निलंबन को ऊपरी कक्ष में रखा जाता है और निचले कक्ष में एक रसायनयुक्त पदार्थ रखा जाता है। न्यूट्रोफिल प्रवास की सीमा का मूल्यांकन फिल्टर में फंसे न्युट्रोफिल की संख्या और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निचले कक्ष में न्यूट्रोफिल की संख्या की गणना करके किया जाता है।
ख। कुओं को एक अर्धनिर्मित आगर में छिद्रित किया गया है:
न्यूट्रोफिल निलंबन, केमोटैक्टिक पदार्थ, और एक गैर-केमोटैक्टिक पदार्थ को विभिन्न कुओं में रखा जाता है। अच्छी तरह से रसायन युक्त पदार्थ की ओर अर्ध ठोस अगर के माध्यम से कोशिकाओं के प्रवास को सूक्ष्म रूप से निर्धारित किया जाता है। गैर-केमोटैक्टिक पदार्थ की ओर प्रवास अच्छी तरह से कोशिकाओं की यादृच्छिक गति (केमो किनेसिस के रूप में जाना जाता है) का प्रतिनिधित्व करता है।
2. न्युट्रोफिल फैगोसाइटोसिस:
न्यूट्रोफिल की फागोसाइटिक क्षमता का आकलन करने के लिए विभिन्न प्रकार के कणों का उपयोग किया जा सकता है। न्यूट्रोफिल के साथ कणों को ऊष्मायन किया जाता है और बाद में सूक्ष्म रूप से न्यूट्रोफिल के अंदर कणों की उपस्थिति के लिए मनाया जाता है। सेल सतह-बाध्य कणों को एसिड उपचार के साथ हटा दिया जाता है, ताकि सेल सतह-बाध्य कणों को इंट्रासेल्युलर कणों के रूप में नहीं गिना जाए।
फ्लोरोसेंट लेबल या रेडियोधर्मी कण जो फागोसाइट्स द्वारा कणों की प्रत्यक्ष गिनती की अनुमति देते हैं, अब उपलब्ध हैं।
3. श्वसन फटने और क्षरण का निर्धारण:
क्रोनिक ग्रैनुलोमैटस बीमारी (सीजीडी) एक इम्यूनोडिफ़िशिएंसी बीमारी है जिसमें फागोसाइट्स द्वारा इंट्रासेल्युलर हत्या सुपर ऑक्साइड आयनों (ओ 2 ) का उत्पादन करने के लिए फ़ैगोसाइट कोशिकाओं की अक्षमता के कारण प्रभावित होती है।
ए। नाइट्रोब्लू टेट्राजोलियम (NBT) स्लाइड परीक्षण:
एनबीटी एक स्पष्ट, पीला, पानी में घुलनशील डाई है। NBT को O 2 से घटाकर एक गहरे नीले रंग में लाया जाता है - । PMA के साथ उपचार या LPS के संपर्क में न्युट्रोफिल सक्रिय हो जाते हैं। सक्रिय न्यूट्रोफिल तो NBT के साथ incubated हैं। यदि न्युट्रोफिल ओ 2 - का उत्पादन करते हैं, तो एनबीटी को गहरे नीले फॉर्मोजेन में घटाया जाता है और इसे माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना की जाती है। एक मात्रात्मक परख न्यूट्रोफिल से formazon को निकालने और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा formazon को परखकर किया जा सकता है। एनएडीपीएच ऑक्सीडेज गतिविधि की पूरी कमी वाले बच्चे एनबीटी परीक्षण में सकल कमी दिखाते हैं। लेकिन एनएडीपीएच ऑक्सीडेज गतिविधि के आंशिक नुकसान वाले बच्चों को मात्रात्मक परख द्वारा बेहतर तरीके से पता लगाया जाता है।
ख। 2'7′-dichloro- fluorescein (DCF) का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्रिक परख:
NADPH ऑक्सीडेज गतिविधि के दौरान गठित O 2 - को एंजाइम सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज द्वारा H 2 O 2 में बदल दिया जाता है। एच 2 ओ 2 एक अन्य माइक्रोबायॉक्साइड रसायन है। H 2 O 2 गैर-फ्लोरोसेंट कंपाउंड DCF को एक फ्लोरोसेंट कंपाउंड में ऑक्सीकृत करता है, जिसे फ्लो साइटोमीटर द्वारा पता लगाया जाता है।
फागोसाइट्स को डीसीएफ के साथ जोड़ा जाता है और डीसीएफ कोशिकाओं में प्रवेश करता है।
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फिर पीएमए या अन्य एजेंटों द्वारा न्युट्रोफिल सक्रिय होते हैं।
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फिर कोशिकाओं का विश्लेषण प्रवाह कोशिकामापी में किया जाता है। फागोसाइट्स के पुष्पक्रम में वृद्धि निर्धारित की जाती है।
फ्लो साइटोमीटर व्यक्तिगत कोशिकाओं द्वारा निर्मित एच 2 ओ 2 की मात्रात्मक निर्धारण की भी अनुमति देता है। इसलिए फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण एनएडीपीएच ऑक्सीडेज फ़ंक्शन में आंशिक दोषों का पता लगाने या सीजीडी के एक्स-लिंक्ड फॉर्म के विषम वाहक के लिए स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है।
4. फैगोसाइट गिरावट:
फागोसिटिक डिग्रेड्यूलेशन फागोसोम के साथ लाइसोसोम के संलयन की एक प्रक्रिया है, जो लाइसोसोमल सामग्री के फेजोलिसोम में निर्वहन के लिए अग्रणी है। गिरावट एक सक्रिय प्रक्रिया है और इसके लिए ऊर्जा की आवश्यकता होती है। न्यूट्रोफिल के सामान्य चयापचय मार्गों (विशेष रूप से, ऑक्सीजन की खपत और हेक्सोज मोनोफॉस्फेट शंट के माध्यम से ग्लूकोज का मांसाहार) की हानि विकृति के साथ हस्तक्षेप करती है; फलस्वरूप, फागोसाइट्स द्वारा रोगाणुओं की इंट्रासेल्युलर हत्या प्रभावित होती है।
एक निलंबन में फागोसाइट्स की गिरावट को विभिन्न सक्रिय एजेंटों और यौगिकों द्वारा प्रेरित किया जा सकता है जो कोशिका के साइटोस्केलेटन को प्रभावित करते हैं (जैसे साइटोक्लासिन बी)। फागोसाइट्स मुख्य रूप से माध्यमिक और तृतीयक कणिकाओं को छोड़ते हैं और उन्हें एलिसा विधियों द्वारा मापा जाता है।
मैं। लैक्टोफेरिन (एक माध्यमिक न्यूट्रोफिल ग्रेन्युल) का उपयोग माध्यमिक ग्रेन्युल रिलीज के मार्कर के रूप में किया जाता है।
ii। एल्ब्यूमिन को तृतीयक ग्रेन्युल रिलीज के एक उपाय के रूप में स्वीकार किया जाता है।
फागोसाइट्स से प्राथमिक ग्रेन्युल रिलीज के लिए परख प्राथमिक ग्रैन्यूल को संलग्न स्थानों में जारी करने की तलाश में किया जाता है। "निराश फागोसिटोसिस" एक परख है जिसका उपयोग प्राथमिक ग्रैन्यूल (चित्र। 27.7) की रिहाई का आकलन करने के लिए किया जाता है।
हीट एग्रीगेटेड इम्युनोग्लोबुलिन या इम्यून कॉम्प्लेक्स पेट्रीश से तय होते हैं।
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न्यूट्रोफिल पेट्रीडिश में जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है। उनके एफसी रिसेप्टर्स के माध्यम से, न्यूट्रोफिल गर्मी के एफसी क्षेत्रों को इम्युनोग्लोबुलिन या इम्यून एंज़ाइम से बाँधते हैं। नतीजतन, न्युट्रोफिल गर्मी एकत्रित इम्युनोग्लोबुलिन या प्रतिरक्षा परिसरों को फागोसिटोज करने की कोशिश करते हैं। लेकिन न्यूट्रोफिल उन्हें फागोसिटोस नहीं कर सकता (क्योंकि वे पेट्री डिश के लिए तय किए गए हैं)। नतीजतन, न्यूट्रोफिल उनके ऊपर अपने दानेदार सामग्री को छोड़ते हैं।
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प्राथमिक ग्रेन्युल प्रोटीन की रिहाई की दर, जैसे कि माइलोपरोक्सीडेज या on-ग्लूकोरोनिडेस का उपयोग गिरावट का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। लेबल किए गए mAbs और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ intracellular कणिकाओं को धुंधला करके प्राथमिक / माध्यमिक कणिकाओं के संश्लेषण में कमी का पता लगाया जा सकता है।
न्यूट्रोफिल द्वारा बैक्टीरियल किलिंग:
सूक्ष्मजीवविज्ञानी assays प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हैं। आम तौर पर, माइक्रोबिसाइडल assays तब की जाती है जब अधिक सरल assays पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं करते हैं।
स्टैफिलोकोकस ऑरियस स्ट्रेन 502A का उपयोग आमतौर पर न्यूट्रोफिल की माइक्रोबायिकाइड क्षमता का आकलन करने के लिए किया जाता है।
लॉग चरण में बढ़ते स्टैफिलोकोकस ऑरियस स्ट्रेन 502A को मानव सीरा (इम्युनोग्लोबुलिन प्रदान करने और प्रोटीन को ओप्सिन के रूप में कार्य करने के लिए पूरक) के साथ जोड़ा जाता है।
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5-10 बैक्टीरिया / न्यूट्रोफिल की एकाग्रता में ताजा पृथक न्यूट्रोफिल जोड़ा जाता है।
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ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद, जिन जीवाणुओं को न्युट्रोफिल द्वारा संलग्न नहीं किया जाता है, वे दवा जेंटामाइसिन के अतिरिक्त द्वारा मारे जाते हैं। (जेंटामिडन न्युट्रोफिल में प्रवेश नहीं करता है और इसलिए फागोसाइटेड बैक्टीरिया जीवित रहता है।)
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न्यूट्रोफिल के विभाजनों को 30 मिनट के अंतराल पर हटा दिया जाता है और न्यूट्रोफिल को निकालने और जीवाणुओं को छोड़ने के लिए बाँझ आसुत जल के साथ मिलाया जाता है। प्रत्येक विभाज्य में व्यवहार्य जीवाणुओं की संख्या को रक्त अगर प्लेटों पर क्रमिक कमजोर पड़ने और चढ़ाना द्वारा मापा जाता है।
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परिणाम एक ग्राफ पर प्लॉट किए जाते हैं।
मैं। सामान्य न्यूट्रोफिल ऊष्मायन के एक घंटे बाद व्यवहार्य अंतःकोशिकीय बैक्टीरिया में दो-लॉग की कमी दिखाते हैं।
ii। वस्तुतः समरूप सीसीडी रोगियों से न्यूट्रोफिल द्वारा कोई हत्या नहीं है।
iii। विषमयुग्मजी सीजीडी वाहकों से न्यूट्रोफिल न्युट्रोफिल द्वारा आंशिक रूप से हत्या दिखाते हैं।
