ठोस, तरल और स्वाब नमूनों से बैक्टीरिया की खेती (चित्रा के साथ)

उद्देश्य:

बैक्टीरिया की खेती के मुख्य उद्देश्य इस प्रकार हैं:

1. बैक्टीरिया की संख्या में वृद्धि, ताकि उन्हें दिखाई रूपों में प्राप्त करने के लिए, कालोनियों या निलंबन के रूप में।

2. बैक्टीरिया का अलगाव।

3. शुद्ध स्टॉक संस्कृति और मानक संस्कृतियों का रखरखाव।

4. नमूनों में बैक्टीरिया की गणना।

5. एक नमूने में रुचि के विशेष जीवाणुओं का पता लगाना और इसका संचय।

6. कॉलोनी विशेषताओं से बैक्टीरिया की पहचान, विभिन्न मीडिया में तिरछी और जैव रासायनिक गतिविधियों पर विकास की विशेषताएं।

हालांकि, इस प्रयोग का उद्देश्य ठोस और तरल मीडिया में तरल, ठोस और सतह के नमूनों से बैक्टीरिया की खेती करना है, ताकि उन्हें क्रमशः कालोनियों या निलंबन के रूप में दृश्य रूपों में प्राप्त किया जा सके।

सिद्धांत:

जीवाणुओं की खेती निष्फल, पोषण से भरपूर तरल या ठोस मीडिया में की जाती है। लिक्विड मीडिया, जिसे शोरबा कहा जाता है, टेस्ट ट्यूबों में 'शोरबा ट्यूब' बनाने के लिए होता है, जबकि ठोस मीडिया, जिसे अग्र मीडिया कहा जाता है, पेट्री डिश में 'एगर प्लेट्स' या बस 'प्लेट्स' बनाने के लिए निहित होता है। बैक्टीरिया की खेती के लिए कुछ सामग्री की आवश्यकता होती है, जिसमें बैक्टीरिया होने का संदेह होता है।

हम जो चीजें देखते हैं उनमें से ज्यादातर में बैक्टीरिया होते हैं। वे दाँत खुरचने, भोजन, मिट्टी, पानी, फेकल पदार्थ और यहां तक कि खुद के बिना सूक्ष्मजीवविज्ञानी मीडिया में भी मौजूद हैं। बैक्टीरिया युक्त किसी भी सामग्री के समरूप निलंबन की एक निश्चित मात्रा को निष्फल मीडिया में निष्क्रिय कर दिया जाता है और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में लगाया जाता है।

तरल शोरबा में, बैक्टीरिया निलंबन के रूप में बढ़ता है और इसे अशांत बनाता है। ठोस अगर प्लेटों पर, वे उपनिवेश के रूप में विकसित होते हैं; प्रत्येक कॉलोनी एकल जीवाणु से बढ़ती है। जीवाणुओं की खेती निम्नलिखित पाँच चरणों में की जाती है।

1. मीडिया की तैयारी

2. मीडिया और कांच-माल की नसबंदी

3. टीकाकरण

4. वृद्धि

5. अवलोकन

1. मीडिया की तैयारी:

आमतौर पर, तरल शोरबा और अर्धनिर्मित मीडिया की तैयारी में, सामग्री को निर्धारित अनुपात में तौला जाता है और आवश्यक मात्रा में पानी में भंग कर दिया जाता है। वर्तमान में, आवश्यक अनुपात में सामग्री युक्त तैयार मीडिया पाउडर उपलब्ध हैं।

तरल शोरबा मीडिया की तैयारी में, पाउडर की निर्धारित मात्रा (पैक के लेबल पर उल्लिखित) को एक शंक्वाकार फ्लास्क में पानी की आवश्यक मात्रा में तौला और भंग किया जाता है। सामग्री को वार्मिंग द्वारा भंग कर दिया जाता है, टेस्ट ट्यूब में डाला जाता है और आटोक्लेव में निष्फल किया जाता है।

लेकिन ठोस प्लेट, तिरछी और गहरी नलियों की तैयारी में, पाउडर की निर्धारित मात्रा (जैसा कि पैक के लेबल पर उल्लिखित है) को तौला जाता है और शंक्वाकार फ्लास्क में आवश्यक मात्रा में पानी में घोल दिया जाता है। यह तैयार माध्यम पहले आटोक्लेव में निष्फल होता है और फिर कुछ समय के लिए ठंडा होने दिया जाता है।

गर्म होने के बावजूद, जमने से पहले, इसे निष्फल पेट्री डिश या टेस्ट ट्यूब में डाला जाता है और कमरे के तापमान पर ठंडा होने पर जमने दिया जाता है। मीडिया को बहुत गर्म स्थिति में कभी भी कंटेनरों में नहीं डालना चाहिए, क्योंकि इससे कंटेनरों की दीवार पर पानी का संघनन होता है, जो मीडिया की सतह पर गिरता है और इसके दूषित होने का कारण बन सकता है।

2. बंध्याकरण:

Glasswares को गर्म हवा के ओवन में 180 ° C पर 3 घंटे के लिए और आटोक्लेव में मीडिया को 121 ° C (15 psi दबाव) पर 15 मिनट के लिए निष्फल किया जाता है। ग्लासवर्क्स को आटोक्लेव में भी निष्फल किया जा सकता है, लेकिन मीडिया को कभी भी ओवन में निष्फल नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि पानी मीडिया से बच जाता है और वे निर्जलीकरण करते हैं।

3. टीकाकरण:

तरल नमूनों को बैक्टीरिया के समरूप निलंबन माना जाता है। इसलिए, शोरबा में खेती के लिए, नमूना की एक निश्चित मात्रा को शोरबा में अनियंत्रित रूप से पाइप किया जाता है। अगर प्लेटों पर खेती के लिए, नमूना की एक निश्चित मात्रा ठोस अगर प्लेट पर pipetted है और मध्यम की सतह पर फैलता है।

ठोस नमूनों के लिए, निश्चित वजन का एक नमूना सामान्य शारीरिक रूप से खारा (0.85% सोडियम क्लोराइड) की एक निश्चित मात्रा में एक नसबंदी मूसल और मोर्टार या एक ब्लेंडर का उपयोग करके समान रूप से homogenized है। अधिकांश मानव रोगजनकों मानव शरीर (0.85% सोडियम क्लोराइड) के लिए आइसोटोनिक हैं।

आमतौर पर नमकीन के लिए नमूने का अनुपात 1: 9 (1 जी + 9 मिलीलीटर; 10 ग्राम + 90 मिलीलीटर; 25 ग्राम + 225 मिलीलीटर या 50 ग्राम + 450 मिलीलीटर) है। इस समरूप तरल की एक निश्चित मात्रा, जिसे बैक्टीरिया का एक समरूप निलंबन माना जाता है, शोरबा संस्कृति के लिए परखनली में निष्फल रूप से निष्फल रूप से पिपेट किया जाता है। अगर प्लेटों पर संस्कृति के लिए, तरल निलंबन प्लेटों की सतह पर pipetted है और aseptically फैल गया है।

ठोस सतहों (तालिका में सबसे ऊपर, शरीर की सतहों या घावों) के माइक्रोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए लिए गए सतह के नमूनों के लिए, सतह को एक निष्फल झाड़ू के साथ मला जाता है। स्टर को एक निष्फल अगर प्लेट की सतह पर स्पर्श किया जाता है। स्पर्श के बिंदु से, धारियों को निष्फल रूप से निष्फल रूप से बनाया जाता है, ताकि जीवाणुओं को अलग किया जा सके।

4. वृद्धि:

एक इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टीका लगाए गए शोरबा ट्यूबों और प्लेटों को लगाया जाता है।

5. अवलोकन:

तरल शोरबा में तनाव और अगर प्लेटों पर कालोनियों बैक्टीरिया की वृद्धि का संकेत है।

आवश्यक सामग्री:

पेट्री डिश (6 नग।), 2-मिली पिपेट (5 नग।), टेस्ट ट्यूब (5 नग।), शंक्वाकार फ्लास्क (100 मिली, 250 मिली और 500 मिली-ली प्रत्येक), 250 मिली बीकर (2 नग)। स्प्रेडर, स्टेनलेस स्टील पिपेट केस, क्राफ्ट पेपर, थ्रेड (या रबर बैंड), गैर-शोषक कपास, छोटी छड़ें, लूप, एथिल अल्कोहल, सोडियम क्लोराइड (NaCl), 0.1N हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCI), 0.1N सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) ), आसुत जल, पोषक तत्व शोरबा, पोषक तत्व अगर, तरल नमूना (जैसे तालाब का पानी), ठोस नमूना (जैसे मिट्टी), सतह का नमूना (जैसे टेबल टॉप, शरीर की सतह, घाव), पीएच पेपर (या पीएच मीटर), मूसल और मोर्टार। (या होमोजेनाइज़र), बन्सन बर्नर, गर्म हवा ओवन, आटोक्लेव, इनक्यूबेटर, लामिना का प्रवाह कक्ष।

प्रक्रिया:

1. पांच पिपेट (एक स्टेनलेस स्टील पिपेट मामले में), छह पेट्री डिश और एक जोड़ी मूसल और मोर्टार (या एक होमोजेनाइजर कप) एक गर्म हवा ओवन में 3 घंटे के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर निष्फल होते हैं। वैकल्पिक रूप से, उन्हें शिल्प पेपर के साथ कवर किया जा सकता है, धागे या रबर बैंड के साथ बांधा जा सकता है और मीडिया (चित्रा 6.1) के साथ आटोक्लेव में निष्फल किया जा सकता है।

2. NaCl का 0.85 ग्राम 250 मिलीलीटर बीकर में आसुत जल के 100 मिलीलीटर में भंग किया जाता है और 90 मिलीलीटर इस खारा समाधान को 100 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में डाला जाता है। मुंह को कपास-प्लग किया जाता है, शिल्प कागज के साथ कवर किया जाता है और धागे या रबर बैंड के साथ बांधा जाता है।

3. शोरबा के 100 मिलीलीटर के लिए आवश्यक पोषक तत्व शोरबा माध्यम के अवयवों का वजन किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, तैयार पोषक तत्व शोरबा पाउडर (घटक मिश्रण) की निर्धारित मात्रा का वजन किया जाता है।

4. सामग्री (या तैयार पाउडर) को 250 मिली शंक्वाकार फ्लास्क में 100 मिलीलीटर आसुत जल में मिलाते हुए और घुमाकर भंग किया जाता है। इसका पीएच पीएच पेपर या पीएच मीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। पीएच 7.0 के लिए समायोजित किया जाता है, 0.1N HCI का उपयोग करते हुए अगर यह अधिक है या 0.1N NaOH का उपयोग कर रहा है यदि यह कम है। कुप्पी को गर्म किया जाता है, यदि आवश्यक हो, तो सामग्री को पूरी तरह से भंग करने के लिए।

5. शोरबा को 5 परीक्षण ट्यूबों (लगभग 10 मिलीलीटर प्रत्येक) में वितरित किया जाता है, उनके मुंह कपास-प्लग किए जाते हैं, शिल्प कागज के साथ कवर किए जाते हैं और धागे या रबर बैंड के साथ बंधे होते हैं।

6. पोषक तत्व अगर मध्यम या 200 मिलीलीटर के लिए आवश्यक इसके तैयार पाउडर के अवयवों को 500 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में 200 मिलीलीटर आसुत जल में तौला और भंग किया जाता है।

इसका पीएच एक पीएच पेपर या पीएच मीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है और यदि यह कम है तो 0.1N HC1 का उपयोग करके 7.0 से समायोजित किया जाता है और यदि यह 0.1N NaOH का उपयोग करता है। पूरी तरह से मध्यम में अगर को भंग करने के लिए फ्लास्क को गर्म किया जाता है। फिर, इसे कपास-प्लग किया जाता है, शिल्प कागज के साथ कवर किया जाता है और धागे या रबर बैंड के साथ बांधा जाता है।

7. छोटी छड़ियों के सुझावों के चारों ओर कपास घुमाकर स्वाब बनाए जाते हैं। कुछ ऐसे स्वैब को टेस्ट ट्यूब में रखा जाता है, जिसमें कॉटन युक्तियां नीचे की ओर होती हैं। परखनली सूती-प्लग वाली होती है, जिसे क्राफ्ट पेपर से ढका जाता है और धागे या रबर बैंड से बांधा जाता है।

8. 90 मिलीलीटर खारा के साथ 100 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क, पोषक तत्व शोरबा के साथ 5 टेस्ट ट्यूब, 500 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क जिसमें 200 मिलीलीटर पोषक तत्व अगर मध्यम और स्वाब युक्त टेस्ट ट्यूब 121 ° C (15i दबाव) पर निष्फल हैं। एक आटोक्लेव में 15 मिनट।

9. नसबंदी के बाद, स्टरलाइज्ड सामग्री को आटोक्लेव से हटा दिया जाता है और कुछ समय के लिए ठंडा करने की अनुमति दी जाती है, बिना माध्यम को जमने के। माध्यम के ठंडा होने से प्लेटों के अंदर पानी की बूंदों के संघनन और संचय को रोकता है। यदि माध्यम पहले से ही तैयार किया गया है और भंडारण के दौरान जम गया है, तो इसे पूरी तरह से पिघलने तक सावधानी से गर्म करके तरलीकृत करना होगा।

10. पोषक तत्व अगर प्लेटों को तैयार करने के लिए, निष्फल पोषक तत्व अगर मध्यम ठंडा होने से पहले और ठोस पिघला देता है, गर्म पिघली हुई स्थिति में, इसे असमान रूप से डाला जाता है, 6 निष्फल पेट्री डिश (लगभग 20 मिलीलीटर प्रत्येक) में, ताकि पिघला हुआ माध्यम नीचे के हिस्से को कवर करे। पेट्री डिश पूरी तरह से।

फिर, प्लेटों को उनके ढक्कन के साथ कवर किया जाता है और ठंडा करने की अनुमति दी जाती है, ताकि उनमें माध्यम को ठोस किया जा सके। लगभग 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में औंधा स्थिति में प्लेटों और पलकों को रखने से प्लेटों और पलकों की आंतरिक सतह पर घनीभूत होने वाले जल वाष्प का वाष्पीकरण हो सकता है।

11. तरल नमूना (बैक्टीरिया को शामिल करने के लिए संदिग्ध, जैसे तालाब का पानी) लिया जाता है। नमूनों में से प्रत्येक एक मिलीलीटर को 2 शोरबा ट्यूबों (चित्रा 6.2) में असमान रूप से पाइप किया जाता है। नलियों को घुमाया जाता है। तरल नमूना भी 2 agar प्लेटों, 0.1 मिलीलीटर प्रत्येक पर aseptically pipetted है, और एक लौ-निष्फल ग्लास स्प्रेडर का उपयोग कर अगर माध्यम की सतह पर फैल गया।

ग्लास स्प्रेडर द्वारा फैलाने से पहले, इसे शराब में डुबोया जाता है और बन्सेन बर्नर के ऊपर फ्लेम किया जाता है। एक इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टीका लगाए गए शोरबा ट्यूबों और प्लेटों को लगाया जाता है। प्लेटों को उल्टे स्थिति में ऊपर, नीचे की ओर ऊष्मायन किया जाता है।

12. सॉलिड सैंपल (उदाहरण के लिए मिट्टी) के लिए, 10 ग्राम के नमूने को असमान रूप से तौला जाता है और 100 मिलीलीटर शंकु फ्लास्क से 90 मिली मात्रा में स्टरलाइज़ किए गए मटर और मोर्टार या होमोजेनाइज़र कप को स्टरलाइज़ किया जाता है।

यह समरूप बैक्टीरिया निलंबन समान रूप से 2 शोरबा ट्यूबों और 2 अगर प्लेटों में 11 चरण में पाइपेट किया जाता है और इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 6.2) पर ऊष्मायन किया जाता है। प्लेटों को उल्टे स्थिति में ऊपर, नीचे की ओर ऊष्मायन किया जाता है।

13. सतह के नमूने के लिए, बैक्टीरिया (तालिका के शीर्ष, शरीर की सतह, घाव) से युक्त सतह को एक इकाई क्षेत्र (जैसे 1 सेमी ² ) के लिए चिह्नित किया जाता है, जिसे एक निष्फल झाड़ू द्वारा रगड़ दिया जाता है। स्वैब को दो बचे हुए अगर प्लेटों की सतह पर छुआ जाता है।

लौ को निष्फल रूप से निष्फल लूप द्वारा किया जाता है। स्ट्रीकिंग के लिए, लगभग समानांतर रेखाएं लूप द्वारा स्वैब-टच पॉइंट से खींची जाती हैं। ये प्राथमिक धारियाँ बनाते हैं। लूप की लौ-नसबंदी के बाद, प्राथमिक धारियों के लिए माध्यमिक धारियाँ लगभग तिरछे खींची जाती हैं। इसी तरह, तृतीयक और चतुर्धातुक धारियाँ असमान रूप से बनाई जाती हैं।

14. फिर, इनक्यूबेटर (चित्रा 6.2) में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर, ऊपर की स्थिति में, प्लेटों को उल्टे स्थिति में ऊष्मायन किया जाता है।

15. एक असिंचित अगर प्लेट और एक असिंचित शोरबा ट्यूब को उचित नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण के रूप में इनक्यूबेट किया जाता है ताकि उनमें कोई वृद्धि न हो। यह कदम वैकल्पिक है।